4.缓冲液洗5min/2次。
5.滴加UltraVBlock，在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。
(注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5-10%正常羊血清，这一步可以省略。)
6.缓冲液洗5min/2次。
7.滴加一抗工作液37℃孵育1-2小时。(具体孵育时间和温度由试验者最终决定)。
8.缓冲液洗5min/2次。
9.滴加PrimaryAntibodyEnhancer(增强子)，在室温下孵育20分钟。
10.缓冲液洗5min/2次。
11.滴加HRPPolymer(酶标二抗)，在室温下孵育30分钟。
(注：HRPPolymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)
12.缓冲液洗5min/2次。
13.向1mlDABPlusSubstrate(或AECPlusSubstrate)中滴加1-2滴DABPlusChromogen(或AECPlusChromogen)，混匀后滴加到切片上，孵育3-15分钟。(具体时间由染色深浅决定。)
14.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
免疫组化注意事项
1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
2.在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：
(1)固相载体的选择
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗体(或抗原)的选择
将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
(3)酶标记抗体工作浓度的选择
首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4)酶的底物及供氢体的选择
对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
结语：以上就是小编为大家介绍的有关于免疫组化的原理以及免疫组化的一些作用。相信大家看完之后对此也是有所了解了，也知道免疫组化有哪些注意事项了。因此，在进行免疫组化的时候，则需要注意这些事项哦。
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